魂斗罗归来怎样限时购:多肽合成技術

多肽化學合成的基本介紹

魂斗罗归来平民枪排名 www.enxtm.icu 多肽化學合成方法,包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現在主要采用BOC和Z兩種?;し椒?,現在主要應用在短肽合成,如阿斯巴甜,力肽,催產素等,其相對與固相合成,具有?;せ≡穸?,成本低廉,合成規模容易放大的許多優點。與固相合成比較,液相合成主要缺點是,合成范圍小,一般都集中在10個氨基酸以內的多肽合成,還有合成中需要對中間體進行提純,時間長,工作量大。固相合成方法現在主要采用FMOC和BOC兩種方法,它具有合成方便,迅速,容易實現自動化,而且可以比較容易的合成到30個氨基酸左右多肽。
1.1.氨基酸?;せ?
20種常見氨基酸,根據側鏈可以分為幾類:脂肪族氨基酸(Ala,Gly,Val,Leu,Ile,),芳香族氨基酸(Phe,Tyr,Trp,His),酰胺或羧基側鏈氨基酸(Asp,Glu,Asn,Gln),堿性側鏈氨基酸(Lys,Arg),含硫氨基酸(Cys,Met),含醇氨基酸(Ser,Thr),亞氨型基酸(Pro)。多肽化學合成中氨基酸的?;し淺9丶?,直接決定了合成能夠成功的關鍵。因為常見的20中氨基酸中有很多都是帶有活性側鏈的,需要進行?;?,一般要求,這些?;せ諍銑曬討形榷?,無副反應,合成結束后可以完全定量的脫除。合成中需要進行?;さ陌被嵐ǎ篊ys,Asp,Glu,His,Lys,Asn,Gln,Arg,Ser,Thr,Trp,Tyr。需要進行?;さ幕牛呼腔?,羧基,巰基,氨基,酰胺基,胍基,吲哚,咪唑等。其中Trp也可以不?;?,因為吲哚性質比較穩定。當然在特殊的情況下,有些氨基酸也可以不?;?,象,Asn,Gln ,Thr,Tyr。
表1 常見3種氨基脫除條件

 

TFA

HBr/TFA

H2/Pd-C

Piperidine/DMF

Boc

y

y

n

n

Z

n

y

y

n

Fmoc

n

y

n

y


圖1 常見3種氨基?;せ峁?br> 氨基酸側鏈?;せ歐淺6?,同一個側鏈有多種不同的?;せ?,可以在不同的條件下選擇性的脫除,這點在環肽以及多肽修飾上具有很重要的意義。而且側鏈?;せ脫≡竦暮銑煞椒ㄓ忻芮械墓叵?,液相和固相不一樣,固相中BOC和FMOC策略也不一樣,從某種意義上看,多肽化學就是氨基酸?;せ牧榛鈐擻糜氪釓?。關于側鏈?;せ氖褂?,請參考王德心的《固相有機合成——原理及應用指南》第四章,我們這里主要介紹Cys,Lys,Asp的幾種?;せ捌渫殉椒?。Cys最常見的?;せ腥?,Trt,Acm,Mob,這三個?;せ梢醞瓿啥嘍遠蚣嚯牡暮銑?。Lys最常見的?;せ校築oc,Fmoc,Trt,Dde,Allyl,這對于固相合成環肽提供了很多正交的?;げ唄?。Asp最常見的?;せ校篛tbu,OBzl,OMe,OAll,OFm,同樣也提供了多種正交的?;げ唄?。
表2 巰基常見?;せ?/p>


簡稱

結構

脫除條件

Trt

TFA,HCl/HOAc,I2/MeOH

Acm

I2/MeOH,Hg2+

Mob

HF,TFMSA,Hg2+

表3 氨基常見?;せ?


簡稱

結構

脫除條件

Trt

TFA,HOAc,HCOOH

Boc

HCl/HOAc,TFA/DCM

Fmoc

Pip/DMF,NaOH/MeOH

Dde

H2NNH2/DMF

Allyl

Pd(Ph3P)4,嗎啉/THF

表3 羧基常見?;せ?


簡稱

結構

脫除條件

Otbu

TFA,HOAc,HCOOH

OBzl

H2/Pd,HF,TFMSA

OMe

NaOH/MeOH

OAll

Pd(Ph3P)4,嗎啉/THF

OFm

Pip/DMF,DBU/DMF

1.2.多肽縮合試劑
目前多肽合成中,主要采用羧基活化方法來完成接肽反應,最早使用的是將氨基酸活化為酰氯,疊氮,對稱酸酐以及混合酸酐的方法,但是由于這些條件下,存在氨基酸消旋,以及反應試劑危險以及制備比較復雜,逐漸被后來的縮合試劑取代,按照其結構可以分為兩種:縮合試劑主要有:碳二亞胺型,鎓鹽型(Uronium)。
1.2.1.碳二亞胺型
主要包括:DCC,DIC,EDC.HCl等。采用DCC進行反應,由于反應中生成的DCU,在DMF中溶解度很小,產生白色沉淀,所以一般不用在固相合成中,但是由于其價格便宜,在液相合成中,可以通過過濾除去,應用仍然相當廣泛。EDC.HCl因為其水溶解性的特點,在多肽與蛋白的連接中使用比較多,而且也相當成功。但是該類型的縮合試劑的一個最大的缺點,就是如果單獨使用,會有比較多的副反應,但是研究表明如果在活化過程中添加HOBt,HOAt等試劑,可以將其副反應控制在很低的范圍。其反應機理如下:

圖2? DIC活化反應機理
1.2.2.鎓鹽型
鎓鹽型縮合試劑反應活性高,速度快,現在使用非常廣泛,主要包括:HBTU,TBTU,HATU,PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機堿,如,二異丙基乙胺(DIEA),N-甲基嗎啉(NMM),該試劑加入后,才能活化氨基酸。其反應機理如下:

圖3? TBTU活化反應機理
1.3.多肽合成方法比較
1.3.1.液相多肽合成(solution phase synthesis)
液相多肽合成現在仍然廣泛的使用,在合成短肽和多肽片段上具有合成規模大,合成成本低的顯著優點,而且由于是在均相中進行反應,可以選擇的反應條件更加豐富,象一些催化氫化,堿性水解等條件,都可以使用,這在固相中,使用卻由于反應效率低,以及副反應等原因,無法應用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應策略。

圖4液相合成Glu-Trp
1.3.2.固相多肽合成

圖5? FMOC固相合成Glu-Trp
固相多肽合成現在使用的主要有兩種策略:BOC和FMOC兩種。BOC方法合成過程中,需要反復使用TFA脫BOC,而且在最后從樹脂上切割下來需要使用HF,由于HF必須使用專門的儀器進行操作,而且切割過程中容易產生副反應,因此現在使用受到實驗條件限制,使用也逐漸減少。FMOC方法反應條件溫和,在一般的實驗條件下就可以進行合成,因此,也得到了非常廣泛的應用。
1.3.2.1.固相合成中常用樹脂
固相合成中樹脂,一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料,大小在75-150μm,交聯度在1-2%之間,現在使用的大多是1%,因為這種交聯度下,樹脂在DMF,DCM中具有很好的溶脹性能,立體上是一個空間網狀結構,反應物分子可以在樹脂內部自由移動。樹脂中最關鍵的部分是連接手臂,它一端連接在樹脂上,一端作為反應位點。目前廣泛使用的樹脂有:PAM,MBHA,Wang,2-Cl-Trt,Rink-Amide-MBHA等。其中PAM,MBHA是用在BOC策略中,因為其對酸非常穩定,需要在HF,TFMSA等強酸條件下才能夠切割下來。

圖6? 固相合成常用樹脂
1.3.2.2.茚三酮檢測
固相多肽合成中,主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率,檢測方法稱為Kaiser方法,其檢測結果,如果有游離氨基的時候,顯示蘭色,或紅褐色(pro,ser,His)。
Kaiser試劑包括:
A,6% 茚三酮的乙醇溶液
B,80% 苯酚的乙醇溶液
C,2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要經過茚三酮處理后,重蒸后再使用。檢測過程,取少量樹脂,加入A,B,C各2-3滴,100℃下加熱1-2min,如果溶液有蘭色,或樹脂出現蘭色,紅褐色,表明還有游離氨基,否則說明連接完全。
還有其它檢測游離氨基的方法:三硝基苯磺酸法,苦味酸法,溴芬蘭法等。

圖7 茚三酮檢測原理
1.3.2.3.固相合成切割方法
固相合成完成之后,必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹脂上切割下來,然后經過冰乙醚沉淀,離心收集沉淀,經過HPLC分離純化,冷凍干燥得到最后產品。由于選擇的樹脂不同,氨基酸序列不同,在切割時候,選擇的切割方法也不完全相同,一般都是選擇酸性條件下切割的條件,對于PAM,MBHA樹脂,一般采用HF切割,切割過程中需要添加對甲苯酚,對巰基苯酚,苯甲醚等試劑。而對于Wang,Rink-Amide,Trt樹脂,一般采用TFA切割,切割過程中加入,乙二硫醇,苯甲硫醚,水,三異丙基硅烷,苯酚等。這些添加試劑主要作為碳正離子俘獲試劑使用,目的是俘獲切割反應過程中生成的碳正離子,減少這些碳正離子對部分氨基酸側鏈的進攻導致的副反應,比較容易產生副反應的氨基酸有:Trp,Tyr。切割試劑用量一般10-15ml/g樹脂。常用的切割配比:HF/p-cresol/p-thiocresol(90/5/5),TFA/TIS/EDT/H2O(94/1/2.5/2.5),反應一般是在室溫條件下2h-4h。
1.3.3.多肽合成中主要問題
1.3.3.1.消旋及其反應機理
多肽合成過程中,部分氨基酸在活化的過程中會導致不同程度的消旋,特別容易消旋的氨基酸有:Cys,His,Phe,當然這些消旋化還和溶劑,溫度以及合成中的有機堿等因素有關。對于這些氨基酸,可以通過采用高效縮合試劑,減少反應時間,可以減少消旋的比例,一般條件選擇適當,消旋化都可以控制在5%以內。消旋反應機理如下:

圖8 消旋反應機理
1.3.3.2.二酮哌嗪(DKP)反應
DKP副反應出現在FMOC-Wang樹脂合成過程中,主要出現在第一個氨基酸為Pro的時候,當第二個氨基酸脫FMOC的時候,α-氨基被游離出來之后,立即對Wang樹脂的芐酯鍵進行分子內胺解,生成六元環二酮哌嗪衍生物,同時從Wang樹脂上釋放出來,導致反應終止。該反應非常迅速,文獻報道采用50%Pip/DMF,脫1min,4min的條件,但是我們實驗證明在多數情況下,即使是1min左右反應就超過了20%。因此一般在末端第一個氨基酸為Pro的時候,建議采用2-Cl-Trt樹脂合成,由于該樹脂巨大的空間阻力,可以完全消除該副反應。這個副反應在BOC策略合成過程中,卻可以完全避免,因為BOC在使用TFA脫除后,使氨基以TFA鹽的形式存在,從而失去了親核性,不能進攻芐酯鍵。

圖9? DKP反應機理
1.3.3.3.困難序列多肽合成
固相多肽合成中也經常遇到多肽合成失敗或合成效率很低的問題,這里面的主要原因是由于多肽序列引起的,因為有些多肽序列在樹脂上形成β-折疊,改變了樹脂的溶脹性能,還有可能將反應的活性位點埋藏在樹脂里面,這樣使得反應很難進行,目前報道使用的主要方法有:

  • 使用混合溶劑,DMSO/DMF,6N 胍啶/DMF溶液
  • 提高反應溫度,或采用微波方法
  • 使用高離液鹽,LiCl,NaClO4等。
  • 使用溶脹性能更好的PEG-PS樹脂,同時減少樹脂擔載量(0.05-0.2mmol/g)

1.4.合成多肽分析鑒定方法
多肽的分析鑒定方法有多肽一級結構,二級結構鑒定,多肽一級結構包括:質譜分析,氨基酸組成分析,氨基酸序列分析。二級結構包括:圓二色譜(CD),NMR,X-衍射等方法。
1.4.1.純度分析
多肽的純度分析,一般都采用HPLC進行分析,選擇RP-C18,粒徑5μm,孔徑300A,4.6×150mm,流動相:A,0.1% TFA/H2O;B,0.1% TFA/ACN,洗脫梯度,5%B--65%B,時間30min。也有些多肽,特別是短肽,由于親水性強,在C18上保留很弱,需要改變條件,這里主要有兩種方法:一個改變分析梯度,可以將起始梯度改為2%,等度或小梯度洗脫;另外一個方法是在流動相中加入強離子對試劑,如七氟丁酸,十八烷基磺酸鈉等。
1.4.2.一級結構分析
1.4.2.1.質譜分析
質譜分析的目的主要是確證分子量,當然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息,但是這個需要比較全的數據庫作為基礎,分析才能比較準確。由于多肽性質不穩定,需要采用軟電離技術,目前多肽分析主要使用了電噴霧(ESI-MS),基質輔助激光解吸(MALDI-MS)。其中ESI-MS通?;岣齠嗟綰煞?,電荷數目和多肽序列上氨基,胍基,咪唑基的數目有關,因此,經常給出了雙電荷,三電荷等離子峰。MALDI-MS可以分析蛋白大分子,而且通常情況下很少帶多電荷,因此數據直接對應了分子離子峰,容易分析。此外,通常在分析長肽或蛋白過程中,需要添加NH4,Na,K等離子,提高靈敏度,所以一般在MS中出現一組峰,分別對應:(M+H)+,(M+NH4)+,(M+Na)+,(M+K)+。
1.4.2.2.氨基酸組成分析
氨基酸組成分析一般需要產品的純度較高,它可以給出多肽中氨基酸的種類,數目。分析過程首先通過酸水解破壞肽鍵,典型酸水解的條件是:真空條件下,110℃,用6M鹽酸水解16至72小時。酸水解雖然很有用,但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析,因為天冬酰胺和谷氨酰胺的側鏈含有酰胺鍵,用于切斷蛋白質肽鍵的酸也可以將天冬酰胺轉換為天冬氨酸,谷氨酰胺轉換為谷氨酸。由于水解溫度比較高,色氨酸的吲哚環容易被空氣氧化,即使在密封的管中,色氨酸的吲哚環也幾乎都被破壞了。因此蛋白質的色氨酸含量往往是通過它的紫外吸收光譜估計的,也可以通過堿水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能精確測定,要精確測量需要在蛋白質水解之前進行氧化或羧甲基化,形成的衍生物在酸水解之后才能定量。
1.4.2.3.氨基酸序列分析
氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解,主要涉及耦聯、水解、萃取和轉換等4個過程。首先使用苯異硫氰酸酯(PITC)在pH9.0的堿性條件下對蛋白質或多肽進行處理,PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物,即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸處理,N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷,釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來將該衍生物用有機溶劑(例如氯丁烷)從反應液中萃取出來,而去掉了一個N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩定,經酸作用,再進一步環化,形成一個穩定的苯乙內酰硫脲(PTH)衍生物,即PTH-氨基酸。留在溶液中的減少了一個氨基酸殘基的肽再重復進行上述反應過程,整個測序過程現在都是通過測序儀自動進行。
1.4.3.二級結構分析
1.4.3.1.圓二色譜(CD)
圓二色譜是一種特殊的吸收譜,它通過測量蛋白質等生物大分子的圓二色光譜,從而得到生物大分子的二級結構,簡單、快捷,廣泛應用在蛋白質折疊,蛋白質構象研究,酶動力學等領域。圓二色譜紫外區段(190-240nm),主要生色團是肽鏈,這一波長范圍的CD譜包含了生物大分子主鏈構象的信息。α-螺旋構象的CD譜在222nm、208nm處呈負峰,在190nm附近有一正峰。β-折疊構象的CD譜,在217-218nm處有一負峰,在195-198nm處有一強的正峰。無規則卷曲構象的CD譜在198nm附近有一負峰,在220nm附近有一小而寬的正峰。
1.4.3.2.核磁共振(NMR)
隨著二維、三維以及四維NMR的應用,分子生物學、計算機處理技術的發展,使NMR逐漸成為大分子結構物質分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列、分布以及構象。目前,NMR在分析分子中含少于30個氨基酸的小肽時是非常有用的,分析結果快速準確。
1.4.3.3.X-衍射
X-衍射可獲得有關化合物晶型的直接信息,而且可以判斷相對與絕對構型。

  • 多肽標記及修飾

目前多肽標記及修飾的內容非常多,廣泛應用在多肽藥物,多肽生物學,多肽抗體以及多肽試劑的研究中。目前應用廣泛的有:非放射性核素標記(C13,H2),熒光標記(FAM,FITC),生物素標記,磷酸化修飾等。
2.1.非放射性核素標記
目前在非放射性核素標記中,使用廣泛的仍然是C13,H2,因為其使用安全,放射性小。現在有比較完全的非放射性標記的氨基酸,可以按照正常的多肽合成方法將標記好的氨基酸直接連接到多肽上。
2.2.熒光標記
熒光標記由于沒有放射性,實驗操作簡單。因此,目前在生物學研究中熒光標記應用非常廣泛,熒光標記方法與熒光試劑的結構有關系,對于有游離羧基的采用的方法與接肽反應相同,也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。但是對于FITC標記,需要在連接FITC前,增加一個氨基己酸,避免在切割的過程中被TFA切割掉。
2.3.生物素標記
生物素-親合素系統 (biotin-avidin system,BAS),是70年代后期應用于免疫學,并得到迅速發展的一種新型生物反應放大系統。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應,并與熒光素、酶、同位素等免疫標記技術有機地結合,使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高。主要有用于標記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最常用,當然,也可以直接使用生物素也可以標記,因為其結構上有個游離的羧基,采用HBTU/HOBt/DIEA方法縮合,由于生物素的溶解度低,使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。
2.4.磷酸肽合成
磷酸肽在生命過程中發揮重要作用,磷酸化的位置在多肽上的Ser,Thr,Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸,目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸,Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法,但是目前采用該方法合成磷酸化也有缺點,特別是在合成多磷酸化多肽或長肽的時候,連接效率低,最后產品純度很低,對于這種磷酸化多肽,我們考慮采用后磷酸化方法,其合成過程就是在多肽合成結束后,選擇性脫去要標記的氨基酸的側鏈?;せ?,對于Tyr,Thr可以直接使用側鏈不?;さ陌被嶠蟹從?,而Ser可以采用Fmoc-Ser(trt),在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化,采用雙芐基亞磷酰胺,四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體,連接到羥基上,隨后在過氧酸下氧化生成磷?;?,完成反應。

  • 蛋白結構與功能模擬多肽

多肽在與蛋白受體結合發揮功能的時候,總是先折疊出某些特殊的結構,多肽類似物合成主要是為了模擬這些結構,保持或提高生物活性,同時也為了改變多肽的穩定性,提高其抗酶解能力。
3.1.α-螺旋多肽
α-螺旋是蛋白結構中最為普通的一種,但是一般多肽在溶液中大多是無規卷曲的,目前使用最多的方法是多肽保持α-螺旋結構就是在多肽表面通過共價鍵將處在α-螺旋結構的兩個氨基酸連接起來,選擇的位點(i,i+4或i,i+7),選擇的化學鍵包括:二硫鍵,硫醚鍵,酰胺鍵,烯烴鍵(RCM)等方法。
3.1.1.二硫鍵
二硫鍵廣泛存在與蛋白結構中,對穩定蛋白結構具有非常重要的意義,二硫鍵一般是通過序列中的2個Cys的巰基,經氧化形成。形成二硫鍵的方法很多:空氣氧化法,DMSO氧化法,過氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成過程,可以通過Ellman檢測以及HPLC檢測方法對其反應進程進行監測。
3.1.2.硫醚鍵
硫醚鍵的形成可以通過序列中的Lys,將溴乙酸連接到Lys的側鏈氨基上,利用其和巰基的特異性反應,反應在緩沖溶液中進行,迅速高效。
3.1.3.酰胺鍵
多肽的內酰胺環肽的合成一般是利用Lys,Asp(Glu)的選擇性?;?,在固相上直接環化。BOC策略中可以采用BOC-Lys(Fmoc),BOC-Asp(OFm),FMOC策略中可以采用FMOC-Lys(Aloc),FMOC-Asp(Allyl)。對于首尾環肽,還可以先合成?;さ畝嚯?,然后在液相中環化生成目標多肽。
3.1.4.烯烴鍵(RCM)
RCM反應是一個過渡金屬催化反應,其反應中使用催化劑:(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh,可以催化烯烴環化,過程中脫去一分子乙烯。

圖10? 固相RCM反應
該反應也可以在固相樹脂上直接環化,反應條件:15-25% (Cy3P)2Cl2Ru=CHPh DCM,60-80℃,24-48h。
3.2.TASP(template-assembled synthetic peptide)多肽
瑞士Basel大學的化學家首次提出TASP的概念,他們利用具有“發夾”結構的肽鏈作為模板,然后將具有α-螺旋結構的多肽直接連接到模板上,模擬蛋白質的高級結構。
3.3.長肽或蛋白合成
3.3.1.FMOC-tbu片段縮合方法
FMOC-tbu片段縮合方法在合成長肽以及蛋白上面運用非常廣泛,其合成過程首先是合成?;ば噪鈉?,經過純化后,將幾個片段在液相或固相上組裝起來。使用本方法主要注意幾個方面:片段的選擇,片段的合成與純化,片段縮合方法。片段選擇要考慮到片段連接反應時間長,容易導致消旋,故片段的C末端最好選擇Gly,Pro。合成的片段一般需要經過C4,C8等純化,對于溶解性很差的多肽,可以采用硅膠柱層析方法進行純化。由于片段的分子大,在樹脂內移動速度慢,故反應時間一般都很長,而且反應過程中與片段濃度關系很大,溶解的時候,盡量提高片段的濃度。對多種條件的選擇,發現采用DMF為溶劑,DIC/HOBt的方法縮合效率最高,消旋也最小。

圖11 FMOC-tbu片段縮合示意圖
3.3.2.自然化學連接(Native Chemical Ligation)
自然化學連接方法的優點是可以采用完全脫?;さ畝嚯?,因此不存在溶解性問題,其反應也是在緩沖水溶液中進行,由于其利用的是巰基和硫酯的特異性反應,再經過由S到N的轉變完成肽鍵的合成。

圖13自然化學連接
總之,今后多肽化學的研究,不僅是將更多的有機化學合成新方法,新技術引入到多肽研究當中,而且對蛋白的結構以及功能模擬,開展結構活性研究(structure activity relationship)將是研究開發的熱點,因為這將為揭示蛋白的內在的生物活性本質提供大量實驗數據。

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